El diagnóstico de los linfomas malignos es una de las áreas que más dificultad reviste dentro de lahistopatología. Si bien muchos casos se diagnostican a través de los datos histomorfológicos e inmunohistoquímicos, ocasionalmente el diagnóstico diferencial entre un proceso reactivo y un linfoma maligno es difícil de establecer.
En estos casos, la detección de clonalidad mediante análisis molecular por PCR de reordenamientos de los genes de las inmunoglobulinas (Ig) y TCR, es un instrumento de gran valor en el diagnóstico de los procesos linfoproliferativos B y T. Los reordenamientos para Ig y TCR se dan en las regiones hipervariables de dichos genes, cada linfocito maduro presenta un reordenamiento específico con una longitud y secuencia únicas en estas regiones.
Por tanto si lo que se amplifica es el ADN de una población linfoide normal o reactiva, el resultado serán múltiples fragmentos dentro de un rango de tamaño determinado, con una distribución Gaussiana. Cuando se amplifica ADN procedente de un proceso tumoral, clonal, todos los fragmentos resultantes serán idénticos en secuencia y tamaño, obteniéndose una banda o pico único mayoritario.
Kit TCR Gamma (MAD- 003994TP-2)
El gen TCRgamma es una diana preferencial para análisis de clonalidad T, ya que se reordena muytempranamente durante el desarrollo linfoide T, probablemente justo después de TCRdelta, tanto en los precursores TCRgd como TCRab.
Este kit permite detectar la presencia de clonalidad en procesos linfoproliferativos de origen T, mediante la amplificación de los segmentos reordenados VJ del gen TCRgamma. Dada la diversidad de secuencias de estos genes TCR, se emplean múltiples cebadores dirigidos frente a regiones conservadas que flanquean los segmentos V y J, con objeto de detectar el mayor número posible de reordenamientos clonales.
TCR Beta (MAD- 003993TP-2)
Este kit permite la detección de clonalidad en los procesos de T - linfoproliferativo, utilizando la amplificación de segmentos reordenados VßJß y DßJß del gen TCRß . Debido a la diversidad de estas secuencias de genes TCR , múltiples cebadores dirigidos a las regiones conservadas que flanquean la V , los segmentos D y J , se utilizan con el fin de detectar el mayor número posible de reordenamientos clonales.
Rearreglos IgH (MAD- 003994BP-2)
Este kit permite detectar la presencia de clonalidad en procesos linfoproliferativos de células B, mediante la amplificación de los segmentos reordenados VDJ de la región hipervariable de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IgH), empleando múltiples cebadores consenso que hibridan con regiones conservadas dentro de dichos genes.
Rearreglos IgK, IgL (MAD- 003999M-2)
Este kit permite la amplificación de los segmentos reordenados Vκ-Jκ y de los dos tipos de reordenamientos Kde (Vk-Kde e intrón-RSS- Kde) para la IgK así como segmentos reordenados Vλ-Jλ de la IgL mediante múltiples cebadores consenso que hibridan con regiones conservadas dentro de dichos genes.
Translocación t(14:18) (MAD- 003997M-2)
El diagnóstico de los procesos linfoproliferativos se ha realizado tradicionalmente en base a las alteraciones morfológicas y peculiaridades citológicas del proceso neoplásico. El análisis inmunofenotípico con anticuerpos específicos, así como la incorporación de los estudios moleculares ha permitido reinterpretar los aspectos morfológicos y establecer una mejor relación con los aspectos biológicos de estas neoplasias, así como conocer sus mecanismos patogenéticos y proporcionar parámetros de valor pronóstico. La hiperplasia linfoide folicular y el linfoma folicular comparten patrones arquitecturales y citológicos y puede plantear problemas de diagnóstico diferencial. Los linfomas del área marginal y manto, pueden confundirse histológicamente con el linfoma folicular. En tales casos, el diagnóstico definitivo requiere la verificación mediante técnicas inmunohistoquímicas y moleculares.
Aunque la detección de la proteína Bcl-2 por métodos inmunohistoquímicos es útil en el diagnóstico diferencial entre las proliferaciones neoplásicas y no neoplásicas originadas en los folículos linfoides, no lo es para el subtipaje de linfomas, ya que muchos de los linfomas de bajo grado son positivos. Para evaluar la clonalidad de los linfomas foliculares se emplean dos marcadores moleculares: el reordenamiento de la cadena pesada IgH y el reordenamiento bcl- 2/IgH asociado con la translocación cromosómica t(14;18).
Esta translocación es la anormalidad citogenética más frecuente en los linfomas foliculares. Supone la fusión del gen bcl-2 desde el brazo largo del cromosoma 18 con la región de unión (JH) del gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina IgH, localizada en el brazo largo del cromosoma 14 y contribuye a la sobreexpresión de la oncoproteína Bcl-2 que desempeña un papel crucial en la patógena de los linfomas foliculares. La proteína Bcl-2 está implicada en mecanismos de control de la apoptosis y prolonga la supervivencia de las células linfoides
La translocación t(14;18) no es exclusiva de los linfomas foliculares sino que puede aparecer hasta en el 25% de los linfomas difusos de células grandes (confiriéndoles mal pronóstico) y en la leucemia linfática crónica. Por otro lado se ha detectado la translocación t(14;18) en sujetos portadores sin neoplasia evidente, lo que sugiere precaución a la hora de interpretar el significado de dicha translocación en ausencia de otros signos de linfoma. El fragmento de fusión entre bcl-2 y la región JH se puede detectar mediante la técnica de amplificación de DNA empleando cebadores homólogos a las secuencias 5’ de las regiones MBR ó MCR del gen bcl-2 y cebadores específicos de la región JH del gen IgH.
Esta técnica de detección supone ventajas en cuanto a rapidez de resultados y elevada sensibilidad a partir de tejidos en fresco o fijados en formalina tamponada e incluidos en parafina.
Translocación t(11:14) (MAD- 003998M-2)
Los linfomas del manto son un subtipo de linfomas no Hodgkin’s que se originan a partir de un grupo de células B vírgenes de la zona del manto de los folículos primarios de los órganos linfoides periféricos.
Histológicamente se caracterizan por la expansión neoplásica de la zona del manto, remedando patrón nodular o infiltrando difusamente el tejido linfoide adyacente. Representan menos del 10% del total de linfomas no Hodgkin’s en adultos. El linfoma del manto se caracteriza genéticamente por la translocación t(11;14) que yuxtapone el locus del gen Bcl-1 ubicado en la banda 11q13 del cromosoma 11, con el gen IgH de las inmunoglobulinas en la región JH del cromosoma 14. Esta translocación está presente en el 60- 70% de todos los linfomas del manto. El gen Bcl-1 codifica para la proteína ciclina D1 implicada en la regulación del ciclo celular.
Tiene un tamaño de 15 kb y cinco exones y a pesar de las rupturas cromosómicas, durante la translocación no se interrumpe su secuencia por lo que en los tumores portadores de ella se produce la sobreexpresión de ciclina D1, que juega un importante papel patogenético en el crecimiento del tumor, probablemente desregulando el control del ciclo celular por superar el efecto supresor de la proteína del retinoblastoma (Rb) y p27Kip1. Existen numerosos puntos de ruptura en el cromosoma 11 implicados en esta translocación.
Uno de ellos, el mayor (MTC), se encuentra a 110 Kb en dirección 5´ al gen Bcl-1. Otros sitios conocidos como sitios menores (mTC1 y mTC2), se encuentran más próximos al gen Bcl-1. Estudios previos han demostrado que el 80% de las rupturas se producen en la región MTC. Los ensayos basados en detectar el “cluster” de translocación MTC mediante amplificación del DNA son capaces de detectar la mayoría de los reordenamientos Bcl-1. Puesto que los linfomas del manto muestran una morfología heterogénea, su clasificación como una entidad diferente fue controvertida durante años. En este momento y considerando que este tipo de tumor puede ser de reconocimiento histológico difícil y de tratamiento relativamente específico, la identificación de las células malignas mediante inmunohistoquímica es obligada (positividad para CD5 y ciclina D1).
Pese a ello, el diagnóstico de algunos casos resulta problemático, por lo que el análisis molecular de la t(11;14) es necesario sobre todo en aquellas biopsias en que el estudio primario no haya sido del todo concluyente.
Debido a la simplicidad y alta sensibilidad de la técnica de amplificación de DNA, la detección por este método de la translocación del gen Bcl-1, proporciona nuevas perspectivas en el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. Además este ensayo permite estudiar la enfermedad mínima residual en pacientes con linfoma de manto, y contribuye a mejorar la determinación del estado de la enfermedad y evaluar el efecto de la terapia. El fragmento de fusión entre el gen Bcl-1 y la IgH se detecta mediante amplificación de DNA empleando cebadores específicos de las secuencias MTC y JH.
Cell lymphoma kit FL (EX-BL.01FL B / Cell lymphoma kit FL (EX-TL.01FL T)
Kit para la evaluación del origen monoclonal o policlonal de los linfomas B y T.
Cuando la distinción de células malignas por su morfología o histoquímica no es suficiente, el estudio del reordenamiento génico ha demostrado ser una herramienta de diagnóstico útil. El análisis se basa en que en principio, todas las células malignas provendrán de una célula única (monoclonal), por lo que todas tendrán el mismo reordenamiento.
Los kits están diseñados para la identificación de las regiones V-D- J de la cadena pesada de la inmunoglobulina en los linfocitos B y de las regiones V-J de la cadena gamma del receptor del linfocito T mediante electroforesis capilar.